O projektu

Název projektu

Studium interakcí obsahových složek nealkoholických nápojů s regulačními dráhami metabolismu léčiv a karcinogeneze

Č. projektu

GAČR 503/10/0579

Období řešení projektu

2010-2012

Anotace projektu

Člověk je trvale vystaven působení mnoha chemických sloučenin, z nichž většina pochází z potravy. Řada sloučenin má schopnost aktivovat tzn. xenoreceptory, tj. aryl uhlovodíkový receptor (AhR) a pregnanový X receptor (PXR), což vede k indukci enzymů metabolizujících cizorodé látky a léčiva. V důsledku dochází ke změně v metabolismu léčiv (tzv. lékovým interakcím), k narušení intermediárního metabolismu (lipidů, sacharidů) a aktivaci prokarcinogenů na karcinogeny. Cílem projektu je studovat vliv obsahových složek nealkoholických nápojů na aktivitu receptorů PXR a AhR. Metodicky budou využity gene reporter assays, analýzy RT-PCR, imunobloting a HPLC. Výstupem projektu budou: (i) validované metodiky testování složek nealkoholických nápojů na aktivity PXR a AhR (ii) publikace v odborném časopise (iii) databáze výsledků přístupná veřejnosti přes webové rozhraní. Přínosem projektu bude zlepšení bezpečnosti a kvality potravin v kontextu předcházení lékovým interakcím, kardiovaskulárním onemocněním a identifikace karcinogenních komponent.

Současný stav problematiky

Lidská populace je každodenně vystavena množství cizorodých látek - xenobiotik, jako jsou léčiva, environmentální polutanty, cigaretový kouř, rostlinné alkaloidy, agrochemikálie, barviva apod. Většina xenobiotik, např. terpeny, flavonoidy, alkaloidy, fytosteroly, fenolické kyseliny, anthokyaniny, oligopeptidy, oligosacharidy, polyfenoly atd., je přijímána v potravě (čaje, koření, plody, zelenina, ovoce, cibuloviny). Kromě přirozeně se vyskytujících obsahových složek je do potravin přidáváno mnoho cizorodých chemikálií, jako jsou stabilizátory, ochucovadla, aromata, antioxidanty, barviva, sladidla apod. Jak přírodní, tak i umělé složky potravin mohou interferovat s regulačními dráhami enzymů metabolizujících léčiva u člověka. Toto může vyústit v tzv. lékové interakce, což je nežádoucí klinická situace kde je farmakokinetika léčiva ovlivněna jinou sloučeninou, tj. xenobiotikem. Příkladem závažné lékové interakce vyvolané složkou potravin je akcelerace metabolismu steroidních hormonů hypericinem (čaje z třezalky tečkované), a to díky indukci enzymů léčiva, což finálně vede k selhání orální antikoncepce. Dalším aspektem nežádoucích složek potravy na lidský organismus je aktivace prokarcinogenů na ultimátní karcinogeny. Příkladem chemicky indukované karcinogeneze je autoindukce některých cytochromů P450 působením polyaromatických uhlovodíků (PAU) obsažených v cigaretovém kouři grilovaném či uzeném mase, což ve finále vyústí v konverzi PAU na silné karcinogeny a v kolorektální nádory.

Molekulární mechanismy zapojené do xenobiotiky-zprostředkovaných lékových interakcí nebo chemicky-indukované karcinogeneze zahrnují indukci (zvýšená synthesa de novo) enzymů metabolizujících léčiva, zejména cytochromů P450. Nejprominentnější a důležité inducibilní cytochromy P450 jsou CYP1A1, CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9 a CYP3A4 (tento enzym zodpovídá za metabolismus cca 60% léčiv). Xenobiotiky-zprostředkovaná indukce cytochromů P450 zahrnuje aktivaci tzv. xenoreceptorů, což jsou ligandy- aktivované transkripční faktory, které jsou zodpovědné za spuštění syntézy cytochromů P450. Receptor pro polyaromatické uhlovodíky (AhR) je zapojen do mnoha buněčných dějů, zprostředkovávajíc odpověď na endogenní signály nebo xenobiotika. Když byl AhR objeven tak se věřilo, že reguluje diskrétní odpověď buňky na cizorodé chemikálie, tj. (i) indukci cytochromu P450 CYP1A1 a CYP1A2, a (ii) toxicitu sloučenin dioxinového typu. V posledních dvou desetiletích bylo ovšem stále jasnější, že kromě role jako receptoru pro xenobiotika hraje AhR úlohu v tak zásadních buněčných dějích jako je vývoj, buněčná diferenciace, imunitní odpověď atd. V současné době je známo mnoho informací o účincích chemických látek na AhR, zejména environmentálních polutantů (polychlorované bifenyly, polyaromatické uhlovodíky atd.), chemikálií a léčiv (omeprazol, lansoprazol). Nicméně, účinky obsahových složek potravin na funkci AhR nebyly systematicky studovány a data v literatuře jsou různorodá. Další, velmi významný xenoreceptor, je pregnanový X receptor (PXR), který transkripčně reguluje enzymy rodin CYP2 a CYP3. Transkripčně aktivní PXR působí ve formě heterodimeru s retinoidním X receptorem (RXR) a tento komplex interakcí se specifickými vazebnými motivy up-reguluje cílové geny, např. CYP3A4. PXR je aktivován mnoha strukturně a chemicky odlišnými ligandy, a to jak xenobiotiky (rifampicin, azolová antimykotika, karbamazepin, hypericin, hyperforin) tak eubiotiky (kyselina lithocholová, 5-pregnan-3,20-dion). Zatímco masivní rozvoj a pokrok ve výzkumu AhR/PXR vedl ke zdokonalení bezpečnosti/testování nových léčiv, výzkum bezpečnosti a kvality potravin byl v tomto aspektu zanedbáván. Navzdory četným (ale osamoceným) náznakům, na závažné účinky obsahových složek potravin na AhR a PXR receptory a následně na metabolismus léčiv nebo karcinogenezi, systematické zkoumání obsahových složek potravy na aktivity AhR a PXR totálně absentuje.

Cíl tohoto projektu je zkoumat účinky obsahových složek nealkoholických nápojů na transkripční aktivitu AhR a PXR a na expresi cytochromů P450 metabolizujících léčiva. Testovány budou zejména ovocné šťávy, zeleninové šťávy, ochucené minerální vody, ochucené sycené nápoje a ledové čaje prodávané v České republice.

Cíle projektu a metody řešení

Cílem projektu je studovat účinky obsahových složek nealkoholických nápojů na transkripční aktivity AhR a PXR receptorů a na expresi enzymů metabolizujících léčiva. Konkrétní cíle pak jsou:

• Příprava standardizovaných extraktů z nealkoholických nápojů.
• Příprava a amplifikace expresních a reportérových plasmidů.
• Screening biologických účinků extraktů na AhR a PXR pomocí gene reporter assays v HepG2 hepatomové linii.
• Konfirmace pozitivních výsledků z bodu 3 pomocí RT-PCR a immunoblot cytochromů P450 v primárních kulturách lidských hepatocytů.
• Identifikace biologicky aktivních obsahových složek pomocí HPLC-MS